Массовый
мониторинг зараженности посадочного материала картофеля вирусами
возможен при использовании простых, надежных и высокочувствительных
лабораторных методов для широкого круга вирусов растений. В настоящее
время в России лабораторная диагностика вирусных инфекций картофеля
осуществляется в основном с помощью методов твердофазного
иммуноферментного анализа (ИФА). Эти методы позволяют количественно
определять вирусы растений в экстрактах листового материала до
концентрации 1 нг/мл. В последнее время большое внимание уделяется
разработке новых простых лабораторных экспресс-методов, позволяющих
проводить анализы в полевых условиях без оборудования и специальных
навыков (Блинцов и др., 2008).
В
настоящей работе представлена высокочувствительная и простая технология
визуальной диагностики вирусных инфекций картофеля на поликомпозитных
мембранных тест-полосках, разработанных учеными биологического
факультета МГУ им М.В. Ломоносова совместно с НИИ ФХБ им. А.Н.
Белозерского, ЗАО «НВО Иммунотех» и ВНИИКХ им. А.Г. Лорха.
В задачи лабораторных испытаний иммунохроматографических тест-полосок для диагностики ХВК, МВК и УВК, проведенных в отделе биотехнологии ВНИИКХ, входило:
- Выявить время анализа в неосветленных экстрактах листьев картофеля.
- Определить порог детекции и рабочий диапазон вирусов картофеля в неосветленных экстрактах листьев здорового растения картофеля.
- Оценить пригодность тест-системы для выявления вируса картофеля в неосветленных экстрактах листьев различных сортов картофеля. Оценить соответствие результатов выявления вируса картофеля в листьях зараженных и здоровых растений картофеля с помощью иммуноферментной и иммунохроматографической тест-систем.
Оборудование, материалы, реагенты для проведения исследований:
- тест-системы, подлежащие испытанию;
- очищенный препарат вируса картофеля с известной концентрацией (определенной спектрофотометрически согласно коэффициенту экстинкции Е (260 нм, 1 см 1 мг/мл);
- экстрагирующий буфер: 0,01 М калий-фосфатный буфер, рН 7,2-7,5, содержащий 0,1 М NaCI, 0,1% Тритон Х-100;
- листья здоровых растений картофеля;
- листья растений картофеля, зараженных вирусами согласно результатам проверки методом иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью иммуноферментных наборов производства ВНИИКХ;
- пробирки пластиковые для образцов емкостью 1,5-2 мл;
- пластиковые или стеклянные лабораторные стаканы емкостью 20-50 мл;
- фарфоровые ступки.
Методика исследований
Перед началом работы тест-системы и образцы листьев растений картофеля выдерживали при комнатной температуре (+18-25°С) в течение 10-15 мин. В комплектацию иммунохроматографической тест-системы для выявления вирусов картофеля должны входить:
- десять тест-полосок, упакованных в индивидуальную упаковку, содержащую пакетик с осушителем (силикагель);
- один флакон, содержащий 50,0 мл экстрагирующего буфера.
Приготовление неосветленного экстракта листьев картофеля (1:10, вес/объем). Готовили навеску листьев массой 200±20 мг и помещали в 2,0 мл экстрагирующего буфера. Растирали в фарфоровой ступке в течение 3—5 мин. Полученный экстракт переносили в пробирку емкостью 3 мл. Препараты соответствующих вирусов картофеля разводили до нужной концентрации экстрагирующим буфером или неосветленным экстрактом листьев здорового растения картофеля. Тест-полоски извлекали из упаковки и помещали в исследуемые образцы. Отмечали появление меток в аналитической зоне иммунохроматографической мембраны.
Результаты исследований
- При исследовании тест-систем на ХВК, МВК, УВК при добавлении данных вирусов в концентрации 50 нг/мл как в буфер, так и в сок здоровых растений картофеля время анализа установлено как 10 минут нахождения тест-полоски в образце. При этом отмечено появление второй отчетливой полосы, сигнализирующей о наличии вируса X, в системе PVY полоса была менее отчетливой, в системе PVM наблюдали фон в контроле (без вируса), одновременно в системе PVX и PVY в контроле констатировали отсутствие второй полосы.
- При определении порога детекции и рабочего диапазона тест-системы на PVX установлено, что через 10 мин. анализа вторая полоса проявляется в диапазоне концентраций от 1000 до 8 нг/мл (исследовался диапазон 1000-2 нг/мл). Через 20 мин. чувствительность была 2 нг/мл. В системе PVY через 10 минут выявлялись концентрации 1000-32нг/мл, через 20 мин. до 8 нг/мл. В системе PVM через 10 минут —1000-16 нг/мл, через 20 минут — до 8 нг/мл.
- При определении пригодности тест-системы для выявления вируса картофеля в неосветленных экстрактах листьев различных сортов картофеля вероятность выявления PVX в концентрации 10 нг/мл составила 100%, PVM —100%, PVY — 60%.
- При изучении соответствия результатов выявления вируса в картофеле в зараженных и здоровых листьях растений картофеля с помощью иммуноферментной и иммунохроматографической тест-систем вероятность выявления PVX со ставила 100% для препаратов, содержащих этот вирус по данным ИФА, и 0% — для препаратов, не содержащих вирус. Вероятность выявления PVY составила 89,1% для препаратов, содержащих этот вирус по данным ИФА и 0% - для препаратов, не содержащих вирус по данным ИФА. Тест-система на PVM не смогла быть оценена из-за фоновой реакции. Иммунохроматографические тест-полоски были способны выявлять вирусы картофеля как в соке зеленых листьев картофеля, так и в соке ростков картофеля. Полевые испытания разработанной иммунохроматографической тест-системы были проведены в 2008 году при отборе базовых здоровых клонов из БЗСК в Архангельской области.
При помощи иммунохроматографических тест-полосок среди всех сортов были выявлены: PVX — в 23 клонах, PVY — в 15 клонах, PVM — в 21 клоне. Это подтверждает эффективность применения данной диагностической системы для выявления наиболее распространенных и опасных вирусов картофеля в полевых условиях. Отобранные клоны, здоровые по данным иммунохроматографии, в настоящее время дополнительно анализируются глазковым тестом с использованием ИФА.
В настоящее время во ВНИИКХ проводятся исследования по совершенствованию и существенному упрощению процесса приготовления диагностируемых образцов из растительного материала в полевых условиях без применения специальных приборов и инструментов.
Таким образом, технология экспресс-диагностики вирусов картофеля на иммунохроматографических тест-полосках представляет собой доступный инструмент для получения здорового семенного материала картофеля. Ее основные достоинства по сравнению с методом ИФА — быстрота проведения анализа (10-15 мин. вместо 2-х дней), независимость места проведения анализа от наличия помещения и оборудования. Вместе с тем недостатком данной технологии является ее высокая трудоемкость при проведении массовых анализов. Данная технология может найти широкое применение как среди крупных производителей семенного картофеля, лабораторий по производству оригинального исходного материала, так и среди картофелеводов-любителей, владельцев личных подсобных хозяйств и дачных участков.
Во ВНИИКХ осваивается производство коммерческих диагностических наборов для лабораторной идентификации вирусов картофеля на основе иммунохроматографических тест-полосок.
Д.В. Кравченко, A.И. Усков, Ю.А. Варицев, п. Красково Московской области
перейти в раздел Статьи
